A restrikciós endonukleázok egy osztálya enzim amelyek vágják a DNS molekulákat. Mindegyik enzim felismeri a nukleotidok egyedi szekvenciáit egy DNS-szálban - általában körülbelül négy-hat bázispár hosszú. A szekvenciák palindromosak, abban az értelemben, hogy a komplementer DNS-szál ugyanaz a szekvencia fordított irányban. Más szavakkal, a DNS mindkét szálát azonos helyre vágjuk.
Hol találhatók ezek az enzimek?
A restrikciós enzimek számos baktériumtörzsben megtalálhatók, ahol biológiai szerepe a sejtvédelemben való részvétel. Ezek az enzimek korlátozzák az idegen (vírusos) DNS-t, amely a sejtekbe kerül, elpusztítva őket. A gazdasejteknek van egy restrikciós módosító rendszere, amely metilezi saját DNS-ét a megfelelő restrikciós enzimekre specifikus helyeken, ezáltal védi őket a hasadástól. Több mint 800 ismert enzimek Felfedezték azokat, amelyek több mint 100 különböző nukleotidszekvenciát felismernek.
A restrikciós enzimek típusai
Öt különféle típusú restrikciós enzim létezik. Az I. típusú véletlenszerű helyeken vágja le a DNS-t, legalább 1000 bázispárig a felismerési helytől. A III típusú vágások körülbelül 25 bázispár távolságban történnek a helytől. Mindkét típus megköveteli ATP-t, és nagy enzimek lehetnek, több alegységgel. A túlnyomórészt a biotechnológiában alkalmazott II. Típusú enzimek a felismert szekvencián belül ATP nélkül vágják le a DNS-t, és kisebbek és egyszerűbbek.
A II. Típusú restrikciós enzimeket azoknak a baktériumfajoknak a alapján nevezték el, amelyekből izolálják őket. Például az EcoRI enzimet izoláltuk az E-ből. coli. A nyilvánosság nagy része ismeri az E-t. coli kitörések az élelmiszerekben.
A II. Típusú restrikciós enzimek kétféle típusú vágást hozhatnak létre attól függően, hogy mindkettőt vágják-e a szál felismerése a felismerési sorozat közepén, vagy az egyes szálak közelebb vannak a felismerés egyik végéhez sorrend.
Az előbbi vágás "tompa végeket" hoz létre, anélkül, hogy nukleotid túlnyúlások lennének. Ez utóbbi "ragacsos" vagy "összetartó" végeket hoz létre, mivel a DNS-nek minden egyes fragmense olyan túlnyúlással rendelkezik, amely kiegészíti a többi fragmenst. Mindkettő hasznos a molekuláris genetikában a készítéshez rekombináns DNS és fehérjék. Ez a DNS-forma abban rejlik, hogy két vagy több olyan szál ligálásával (összekapcsolásával) jön létre, amelyek eredetileg nem voltak összekapcsolva.
A IV. Típusú enzimek felismerik a metilezett DNS-eket, és az V. típusú enzimek RNS-eket használnak szekvenciák vágására olyan inváziós szervezetekben, amelyek nem palindromok.
Használat a biotechnológiában
A restrikciós enzimeket a biotechnológiában használják a DNS kisebb részekre vágására, hogy az egyes egyedek között meg lehessen vizsgálni a fragmentumhossz-különbségeket. Ezt restrikciós fragmens hosszúságú polimorfizmusnak (RFLP) nevezzük. Génklónozásra is használják.
RFLP technikák A vizsgálatokat arra használtuk, hogy meghatározzuk, hogy az egyének vagy az egyének csoportjai megkülönböztethető különbségeket mutatnak a génszekvenciákban és a genom bizonyos területein a restrikciós hasítási mintákban. Ezen egyedi területek ismerete képezi az alapot DNS ujjlenyomat. Ezen módszerek mindegyike a agaróz gél elektroforézis a DNS-fragmensek elválasztására. Az agarózgélben általában a TBE puffert, amely Tris-bázisból, bórsavból és EDTA-ból áll. elektroforézis DNS-termékek vizsgálata.
Használat a klónozásban
A klónozáshoz gyakran szükséges egy gént beilleszteni egy plazmidba, amely egy DNS-darab típusa. A restrikciós enzimek elősegíthetik a folyamatot az egyszálú túlnyúlások miatt, amelyeket vágáskor elhagynak. A DNS-ligáz, egy különálló enzim, összekapcsolhat két, egymással megegyező végű DNS-molekulát.
Tehát, ha restrikciós enzimeket alkalmazunk a DNS-ligáz enzimekkel, a különböző forrásokból származó DNS darabokat felhasználhatjuk egyetlen DNS-molekula létrehozására.