Hogyan működik a polimeráz láncreakció a gének felerősítésében

A polimeráz láncreakció (PCR) egy molekuláris genetikai technika egy gén többszörös másolatának elkészítésére, és egyben a génszekvenálási folyamat része is.

A génmásolatok DNS-minta felhasználásával készülnek, és a technológia elég jó ahhoz, hogy a mintában található gén egyetlen másolatáról több másolatot készítsenek. Egy gén PCR-amplifikációja több millió másolat készítéséhez lehetővé teszi a génszekvenciák kimutatását és azonosítását vizuális technikák segítségével a DNS-darab mérete és töltése (+ vagy -) alapján.

Ellenőrzött körülmények között a DNS-polimerázok néven ismert enzimek kis DNS-szegmenseket állítanak elő, amelyek komplementer dezoxinukleotidokat adnak hozzá. (dNTP-k) a „templátként” ismert DNS-darabhoz. Még kisebb DNS-darabokat, úgynevezett "primereket" használnak a kiindulási pontként polimeráz.

A primerek kis, mesterséges DNS-darabok (oligomerek), általában 15 és 30 nukleotid hosszúak. Az amplifikált gén legvégén található rövid DNS-szekvenciák ismerete vagy kitalálása révén jönnek létre. A PCR során a szekvenált DNS-t felmelegítik, és a kettős szálak elválik. Lehűléskor a primerek a templáthoz kötődnek (ezt nevezik annealingnak), és helyet hoznak létre a polimeráz megkezdéséhez.

A polimeráz láncreakciót (PCR) a termofil és termofil sejtek felfedezése tette lehetővé polimeráz enzimek (olyan enzimek, amelyek magas hőmérsékleten melegítés után fenntartják a szerkezeti integritást és funkcionalitást hőmérsékletek). A PCR-technika lépései a következők:

• Keverék jön létre a DNS-templát, a polimeráz enzim, a primerek és a dNTP-k optimalizált koncentrációjával. Az a képesség, hogy a Az enzim denaturálása nélküli keverék lehetővé teszi a DNS-minta kettős hélixének denaturálását 94 fokos hőmérsékleten Celsius.
• A denaturálást követően a mintát mérsékeltebb tartományra, 54 fok körüli hőmérsékletre hűtjük, ami megkönnyíti a primerek összekapcsolódását (kötődését) az egyszálú DNS-templátokhoz.
• A ciklus harmadik lépésében a mintát újra felmelegítik 72 fokra, ez az ideális hőmérséklet a Taq DNS polimeráz számára a megnyújtáshoz. Az elongáció során a DNS-polimeráz a DNS eredeti egyszálát használja templátként a komplementer dNTP-k hozzáadásához. az egyes primerek 3'-végére, és létrehoz egy kétszálú DNS-szakaszt a kérdéses gén régiójában.
• Azok a primerek, amelyek olyan DNS-szekvenciákhoz kapcsolódnak, amelyek nem pontosan illeszkednek egymáshoz, nem maradnak 72 fokon illesztve, így korlátozva a megnyúlást a kérdéses génre.

Ez a denaturálási, lágyítási és elongációs folyamat többszörösen (30-40) megismétlődik, ezáltal exponenciálisan növeli a kívánt gén másolatainak számát a keverékben. Bár ez a folyamat meglehetősen fárasztó lenne, ha manuálisan hajtják végre, a minták elkészíthetők és inkubálhatók a programozható Thermocycler, amely ma már általános a legtöbb molekuláris laboratóriumban, és a teljes PCR-reakció végrehajtható 3-4 óra.

Minden denaturálási lépés leállítja az előző ciklus elongációs folyamatát, így csonkolja az új DNS-szálat, és megközelítőleg a kívánt gén méretére tartja. Az elongációs ciklus időtartama meghosszabbítható vagy lerövidíthető a kérdéses gén méretétől függően, de végül ismételt ciklusokkal A PCR során a templátok többsége kizárólag a kérdéses gén méretére korlátozódik, mivel ezeket mindkét gén termékeiből állítják elő. alapozók.

Többféle is létezik A sikeres PCR tényezői amelyek manipulálhatók az eredmények javítása érdekében. A legszélesebb körben használt módszer a PCR-termék jelenlétének vizsgálatára agaróz gél elektroforézis. Amely a DNS-fragmensek méret és töltés alapján történő szétválasztására szolgál. A töredékeket ezután színezékek vagy radioizotópok segítségével vizualizálják.

A PCR felfedezése óta az eredeti Taq-tól eltérő DNS-polimerázokat fedeztek fel. Ezek egy része jobb „lektori” képességgel rendelkezik, vagy magasabb hőmérsékleten stabilabb, így javítja a PCR specifitását és csökkenti a hibás dNTP beillesztéséből származó hibákat.

A PCR egyes változatait speciális alkalmazásokhoz tervezték, és mára rendszeresen használják a molekuláris genetikai laboratóriumokban. Ezek közül néhány a valós idejű PCR és a reverz transzkriptáz PCR. A PCR felfedezése a DNS-szekvenálás kifejlesztéséhez is vezetett, DNS ujjlenyomat és más molekuláris technikák.