A területe biotechnológia az egyik állandó változás. Az élvonalbeli kutatás gyors növekedése és fejlődése az innovációtól és a kreativitástól függ tudósok és képességeik, hogy megismerjék az alapvető molekuláris technikákban rejlő lehetőségeket és alkalmazzák az új lehetőségeket folyamatokat. A polimeráz láncreakció megjelenése (PCR) számos ajtót nyitott a genetikai kutatásban, ideértve a DNS-elemzés és a különböző gének azonosítása a DNS-szekvenciáik alapján. A DNS-szekvenálás a felhasználási képességünktől is függ gélelektroforézis olyan DNS-szálak elválasztására, amelyek méretükben csak egy bázispárral különböznek egymástól.
DNS szekvenálás
Az 1970-es évek végén két DNS-szekvenálási technikát találtak hosszabb DNS-molekulákra: a Sanger (vagy dideoxi) módszert és a Maxam-Gilbert (kémiai hasítás) módszert. A Maxam-Gilbert módszer a vegyi anyagok általi nukleotid-specifikus hasításon alapszik, és leginkább az oligonukleotidok szekvenálására használható (rövid nukleotid polimerek, általában kevesebb, mint 50 bázispár). A Sanger-módszert gyakrabban használják, mert technikailag könnyebben alkalmazható, és a A PCR megjelenése és a technika automatizálása könnyen alkalmazható a hosszú DNS-szálakra, beleértve az egészet is géneket. Ez a technika a nagyoxinukleotidok láncmegszakításán alapszik, a PCR megnyúlási reakciók során.
Sanger módszer
A Sanger-módszerben az analizálandó DNS-szálat templátként használják, és a DNS-polimerázt PCR-reakcióban komplementer szálak előállításához használják primerek felhasználásával. Négy különböző PCR reakciókeveréket állítunk elő, amelyek mindegyike tartalmaz bizonyos százalékban a nagyoxinukleozid-trifoszfát (ddNTP) analógokat a négy nukleotid egyikéhez (ATP, CTP, GTP vagy TTP).
Az új DNS-szál szintetizálása mindaddig folytatódik, amíg ezen analógok egyikét be nem építették, amikoris a szál idő előtt csonkodik. Az egyes PCR-reakciók különböző hosszúságú DNS-szálak keverékét tartalmazzák, amelyek mindegyike azzal a nukleotiddal végződik, amelyet a reakcióhoz nagyoxi-jelölésnek vettek alá. Gél elektroforézis Ezután a négy reakció szálainak négy különálló sávban történő elválasztására szolgál, és az eredeti templát szekvenciájának meghatározására annak alapján, hogy a szál hossza melyik nukleotiddal végződik.
Az automatizált Sanger-reakcióban olyan primereket használnak, amelyeket négy különböző színű fluoreszcens címkével jelölnek. A PCR reakciókat a különféle dideoxinukleotidok jelenlétében a fentiek szerint hajtjuk végre. Ezután a négy reakcióelegyet ezután egyesítjük és egy gél sávjára visszük fel. Az egyes fragmensek színét lézernyaláb segítségével detektáljuk, és az információkat egy számítógép gyűjti amely kromatogramot készít minden szín csúcsát mutatva, amelyből a templát DNS szekvencia származhat eltökélt.
Általában az automatizált szekvenálási módszer csak legfeljebb 700-800 bázispár hosszúságú szekvenciákra pontos. Lépésenként módszerekkel, például Primer Walking és Shotgun szekvenálással is meg lehet szerezni a nagyobb gének teljes szekvenciáját és valójában a teljes genomot.
A Primer Walking során egy nagyobb gén működőképes részét szekvenáljuk Sanger módszerrel. Új primereket állítunk elő a szekvencia megbízható szegmenséből, és azokat a gén azon részének szekvenálására használjuk, amely az eredeti reakció tartományán kívül esett.
A lövöldözős szekvenálás véletlenszerűen elvágja az érdeklődésre számot tartó DNS-szegmenst (kezelhető) méretű fragmenseket, az egyes fragmentumokat szekvenálva, és a darabokat egymást átfedő módon rendezve szekvenciákat. Ezt a technikát megkönnyítette az átfedő darabok elrendezésére szolgáló számítógépes szoftver alkalmazása.