Fehérjetisztítási módszerek a biotechnológiában

A biotechnológiai kutatás fontos eleme a fehérjetervezési technikák alkalmazása a fehérjék megtervezésére vagy módosítására. Ezek a fehérjetisztítási technikák optimalizálják a fehérjék tulajdonságait specifikus ipari alkalmazásokhoz.

Ezek a technikák megkövetelik a tudósoktól, hogy izolálják és tisztítsák az érdeklődésre számot tartó fehérjéket, hogy ezek konformációi és szubsztrát-specifitása megvizsgálható legyen. Tanulmányozást igényelnek más ligandumokkal (egy protein, amely kapcsolódik egy receptorfehérjéhez) történő reakciók és a specifikus enzimaktivitások.

A szükséges fehérje tisztaság mértéke a fehérje tervezett végső felhasználásától függ. Egyes alkalmazásokhoz elegendő a nyers kivonat. Egyéb felhasználások, például élelmiszerekben és gyógyszerekben, magas szintű tisztaságra van szükség. Több módszer fehérjetisztítás a szükséges tisztasági szint elérésére használják.

Minden egyes fehérjetisztítási lépés bizonyos mértékű termékvesztést eredményez. Ezért az ideális fehérjetisztítási stratégia az, amelyben a tisztítás legmagasabb szintjét a legkevesebb lépésben érik el.

Az alkalmazandó lépések kiválasztása a célfehérje méretétől, töltésétől, oldhatóságától és egyéb tulajdonságaitól függ. Az alábbi eljárások a legmegfelelőbbek egyetlen citoszolos protein tisztításához.

A citoszolos fehérjekomplexek tisztítása bonyolultabb, és általában eltérő módszerek alkalmazását igényli.

Az intracelluláris (a sejt belsejében) fehérjék tisztításának első lépése a nyers kivonat előállítása. Az extraktum a sejt citoplazmában levő összes fehérje komplex keverékét, valamint néhány további makromolekulát, kofaktorot és tápanyagot tartalmaz.

Ez a nyers kivonat felhasználható bizonyos alkalmazásokban a biotechnológiában. Ha azonban a tisztaság kérdés, akkor a következő tisztítási lépéseket kell követni. A nyersfehérje-extraktumokat úgy állítják elő, hogy eltávolítják a sejtlízis során keletkező celluláris törmeléket, amelyet vegyi anyagokkal érnek el, enzimek, szonikálás vagy egy francia sajtó.

A törmeléket centrifugálással eltávolítják, és a felülúszót (a szilárd maradék feletti folyadék) kinyerik. Az extracelluláris (sejten kívüli) fehérjék nyers készítményei a sejtek centrifugálással történő egyszerű eltávolításával állíthatók elő.

Bizonyos biotechnológia Alkalmazások esetén igény van hőstabil enzimekre - enzimekre, amelyek denaturálás nélkül képesek elviselni a magas hőmérsékletet, miközben fenntartják a magas fajlagos aktivitást.

A hőálló fehérjéket termelő organizmusokat néha extremophilesnek hívják. A hőálló fehérje tisztításának egyszerű módja az, hogy a keverékben lévő többi fehérjét denaturálja melegítjük, majd lehűtjük az oldatot (ezáltal lehetővé téve a hőstabil enzim reformját vagy újraoldódását, ha szükséges). A denaturált fehérjéket ezután centrifugálással eltávolíthatjuk.

Modern biotech A protokollok gyakran kihasználják a sok kereskedelemben kapható készletet vagy módszert, amelyek kész megoldásokat kínálnak a szokásos eljárásokhoz. A fehérjetisztítást gyakran szűrőkkel és előkészített gélszűrő oszlopokkal végezzük.

Kövesse a dialíziskészlet utasításait, adjon hozzá a megfelelő mennyiségű oldatot és várja meg a a meghatározott időtartamot az eluens (az oldószer áthaladása az oszlopon) friss vizsgálat során történő gyűjtése során cső.

A kromatográfiás módszereket bench-top oszlopokkal vagy automatizált HPLC berendezéssel lehet alkalmazni. A HPLC-vel történő elválasztást fordított fázisú, ioncserélő vagy méretkizárási módszerekkel lehet elvégezni, és a mintákat diódarendszerrel vagy lézer technológiával detektálhatjuk.

A múltban a fehérje nyers kivonatból történő tisztításának általános második lépése nagy ozmotikus szilárdságú oldatban (azaz sóoldatban) történő kicsapás volt. A fehérje kicsapását általában sóként ammónium-szulfát felhasználásával végezzük. A nyers kivonatban levő nukleinsavak eltávolíthatók sztreptomicin-szulfáttal vagy protamin-szulfáttal képződött aggregátumok kicsapásával.

A só kicsapódása általában nem eredményez erősen tisztított fehérjét, hanem elősegítheti a nem kívánt fehérjék eltávolítását a keverékben és a minta koncentrálását. Az oldatban lévő sókat ezután porózus cellulózcsővel, szűréssel vagy gélkibocsátási kromatográfiával dialízissel távolítják el.

Különböző fehérjék csapódnak ki különböző koncentrációban ammónium-szulfátban. Általában a nagyobb molekulatömegű proteinek alacsonyabb ammónium-szulfát koncentrációban csapódnak ki.

A fordított fázisú kromatográfia (RPC) elválasztja a fehérjéket azok relatív hidrofób tulajdonságai alapján (a nem poláros molekulák kizárása a vízből). Ez a módszer nagyon szelektív, de szerves oldószereket igényel.

Néhány fehérjét az oldószerek tartósan denaturálnak, és az RPC során elveszítik a funkcionalitást. Ezért ezt a módszert nem ajánlott minden alkalmazáshoz, különösen akkor, ha szükséges a célfehérje az aktivitás megtartásához.

Az ioncserélő kromatográfia a fehérjék töltésen alapuló elválasztását jelenti. Az oszlopok előállíthatók anioncserére vagy kationcserére. Az anioncserélő oszlopok egy álló fázist tartalmaznak pozitív töltéssel, amely vonzza a negatív töltésű fehérjéket.

A kationcserélő oszlopok a fordított, negatív töltésű gyöngyök, amelyek vonzzák a pozitív töltésű fehérjéket. A célfehérje (k) kivonását (az anyag extrahálását a másikból) a pH-érték megváltoztatásával hajtjuk végre az oszlop, amely megváltoztatja vagy semlegesíti az egyes töltött funkciós csoportokat fehérje.

A méretkizárásos kromatográfia (más néven gélszűrés) elválasztja a nagyobb fehérjéket a kisebbiktől mivel a nagyobb molekulák gyorsabban haladnak át a térhálósított polimeren a kromatográfiában oszlop. A nagy fehérjék nem illeszkednek a polimer pórusaiba, míg a kisebb fehérjék kevésbé közvetlen útvonalon haladnak tovább a kromatográfiás oszlopon.

Az eluátumot (az elúció eredménye) csövek sorozatában gyűjtjük össze, amely elválasztja a fehérjéket az eluálási idő alapján. A gélszűrés hasznos eszköz a fehérjeminták koncentrálására, mivel a célfehérjét kisebb eluációs térfogatban gyűjtik össze, mint amelyet eredetileg az oszlophoz adtak. Hasonló szűrési technikák alkalmazhatók a nagy volumenű fehérjetermelés során, költséghatékonyságuk miatt.

Az affinitáskromatográfia nagyon hasznos módszer a "polírozáshoz", vagy a fehérjetisztítási folyamat befejezéséhez. A kromatográfiás oszlop gyöngyöi térhálósítottak olyan ligandumokkal, amelyek specifikusan kötődnek a célfehérjéhez.

Ezután a fehérjét az oszlopból szabad ligandumokat tartalmazó oldattal öblítjük. Ez a módszer a legtisztább eredményeket és a legmagasabb fajlagos aktivitást adja más technikákhoz képest.

Az SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakril-amid gél elektroforézissel) kötődik a fehérjékhez, így nagy nettó negatív töltést eredményez. Mivel az összes fehérje töltése meglehetősen egyenlő, ez a módszer szinte teljes egészében elválasztja őket méretük alapján.

Az SDS-PAGE-t gyakran használják a fehérje tisztaságának tesztelésére egy sorozat minden egyes lépése után. Mivel a nem kívánt fehérjéket fokozatosan eltávolítják az elegyből, az SDS-PAGE gélen láthatóvá váló sávok száma csökken, amíg csak egy sáv van, amely a kívánt fehérjét képviseli.

Az immunoblot fehérjemegjelenítő technika, affinitáskromatográfiával kombinálva. Egy specifikus protein ellenanyagait ligandumokként használjuk affinitáskromatográfiás oszlopon.

A célfehérjét megtartjuk az oszlopon, majd az oszlopot sóoldattal vagy más szerekkel öblítjük. A radioaktív vagy festékjelzéssel összekapcsolt antitestek elősegítik a célfehérje kimutatását, miután elválasztották a keverék többi részétől.