PCR jelentése polimeráz láncreakció, molekuláris biológiai technika a DNS szegmenseinek amplifikálására, többszörös másolatok előállításával, DNS polimeráz enzimekkel, szabályozott körülmények között. Alig egy DNS-szegmens vagy gén egyetlen példányát több millió példányba lehet klónozni, lehetővé téve a festékek és más megjelenítési technikák felhasználásával történő kimutatást.
Az 1983-ban kifejlesztett PCR-folyamat lehetővé tette a végrehajtást DNS szekvenálás és azonosítja a nukleotidok sorrendjét az egyes génekben. Az eljárás során a hőkezelést vagy a reakció ismételt melegítését és lehűtését a DNS olvadásához és replikációjához használjuk. Ahogy a PCR folytatódik, az „új” DNS-t templátként használják a replikációhoz, és egy láncreakció következik be, amely a DNS-templát exponenciálisan felerősödik.
A PCR technikákat a biotechnológia számos területén alkalmazzák, ideértve a fehérjetechnika, klónozás, kriminalisztika (DNS-ujjlenyomat), apasági vizsgálat, örökletes és / vagy fertőző betegségek diagnosztizálása, valamint elemzés környezeti minták.
Különösen a kriminalisztikában a PCR különösen akkor hasznos, mert még a legkisebb mennyiségű DNS-bizonyítékot is amplifikálja. A PCR felhasználható a több ezer éves DNS elemzésére is. Ezeket a technikákat mindent meg lehet határozni egy 800 000 éves mamuttól a világ minden tájáról származó múmiákig.
PCR eljárás
inicializálás
Ez a lépés csak olyan DNS-polimerázok esetén szükséges, amelyek melegindítási PCR-t igényelnek. A reakcióelegyet 94-96 ° C-ra melegítjük és 1-9 percig tartjuk.
Denaturáiás
Ha az eljárás nem igényel inicializálást, akkor az első lépés a denaturálás. A reakcióelegyet 94-98 ° C-ra melegítjük 20-30 másodpercig. A DNS-templát hidrogénkötései megszakadnak, és egyszálú DNS-molekulák alakulnak ki.
Lágyító
A reakció hőmérséklete 50 és 65 ° C között van, és 20-40 másodpercig tart. A primerek az egyszálú DNS-templáthoz kapcsolódnak. A hőmérséklet ebben a lépésben rendkívül fontos. Ha túl meleg, akkor az alapozó nem kötődik hozzá. Ha túl hideg, akkor az alapozó nem tökéletesen kötődik össze. Jó kötés akkor alakul ki, ha a primer szekvencia szorosan megegyezik a templát szekvenciával.
Extension / Nyúlás
A hőmérséklet ebben a lépésben a polimeráz típusától függ. A DNS-polimeráz egy teljesen új DNS-szálat szintetizál.
Végső megnyúlás
Ezt a lépést 70-74 ° C-on hajtjuk végre az utolsó PCR ciklus után 5-15 percig.
Végső tartás
Ez a lépés nem kötelező. A hőmérsékletet 4-15 ° C-on tartjuk, és a reakciót elválasztjuk.
A PCR eljárás három szakasza
Exponenciális erősítés
Minden ciklus alatt a termék (a specifikus replikált DNS darab) megduplázódik.
Szintező szakasz
Mivel a DNS-polimeráz elveszíti aktivitását és reagenseket fogyaszt, a reakció lelassul.
Fennsík
Nincs több termék felhalmozódása.